多肽缩合的试剂

多肽缩合的试剂

目前多肽合成中,主要采用羧基活化方法来完成接肽反应,最早使用的是将氨基酸活化为酰氯,叠氮,对称酸酐以及混合酸酐的方法,但是由于这些条件下,存在氨基酸消旋,以及反应试剂危险以及制备比较复杂,逐渐被后来的缩合试剂取代,按照其结构可以分为两种:缩合试剂主要有:碳二亚胺型,鎓盐型(Uronium)。
 
1.2.1.碳二亚胺型 

      主要包括:DCC,DIC,EDC.HCl等。采用DCC进行反应,由于反应中生成的DCU,在DMF中溶解度很小,产生白色沉淀,所以一般不用在固相合成中,但是由于其价格便宜,在液相合成中,可以通过过滤除去,应用仍然相当广泛。EDC.HCl因为其水溶解性的特点,在多肽与蛋白的连接中使用比较多,而且也相当成功。但是该类型的缩合试剂的一个最大的缺点,就是如果单独使用,会有比较多的副反应,但是研究表明如果在活化过程中添加HOBt,HOAt等试剂,可以将其副反应控制在很低的范围。其反应机理如下: 


图2  DIC活化反应机理 

1.2.2.鎓盐型 
     鎓盐型缩合试剂反应活性高,速度快,现在使用非常广泛,主要包括:HBTU,TBTU,HATU,PyBOP等。该试剂使用过程中需要添加有机碱,如,二异丙基乙胺(DIEA),N-甲基吗啉(NMM),该试剂加入后,才能活化氨基酸。其反应机理如下: 


固相合成中常用树脂 
       固相多肽合成中树脂,一般都是聚苯乙烯-二乙烯苯材料,大小在75-150μm,交联度在1-2%之间,现在使用的大多是1%,因为这种交联度下,树脂在DMF,DCM中具有很好的溶胀性能,立体上是一个空间网状结构,反应物分子可以在树脂内部自由移动。树脂中最关键的部分是连接手臂,它一端连接在树脂上,一端作为反应位点。目前广泛使用的树脂有:PAM,MBHA,Wang,2-Cl-Trt,Rink-Amide-MBHA等。其中PAM,MBHA是用在BOC策略中,因为其对酸非常稳定,需要在HF,TFMSA等强酸条件下才能够切割下来。 


固相合成切割方法
       固相多肽合成完成之后,必须选择合适的切割试剂将多肽从树脂上切割下来,然后经过冰乙醚沉淀,离心收集沉淀,经过HPLC分离纯化,冷冻干燥得到最后多肽产品。
        由于选择的树脂不同,氨基酸序列不同,在切割时候,选择的切割方法也不完全相同,一般都是选择酸性条件下切割的条件,对于PAM,MBHA树脂,一般采用HF切割,切割过程中需要添加对甲苯酚,对巯基苯酚,苯甲醚等试剂。而对于Wang,Rink-Amide,Trt树脂,一般采用TFA切割,切割过程中加入,乙二硫醇,苯甲硫醚,水,三异丙基硅烷,苯酚等。
      这些添加试剂主要作为碳正离子俘获试剂使用,目的是俘获切割反应过程中生成的碳正离子,减少这些碳正离子对部分氨基酸侧链的进攻导致的副反应,比较容易产生副反应的氨基酸有:Trp,Tyr。切割试剂用量一般10-15ml/g树脂。
      常用的切割配比:HF/p-cresol/p-thiocresol(90/5/5),TFA/TIS/EDT/H2O(94/1/2.5/2.5),反应一般是在室温条件下2h-4h。

困难序列多肽合成
      固相多肽合成中也经常遇到多肽合成失败或合成效率很低的问题,这里面的主要原因是由于多肽序列引起的,因为有些多肽序列在树脂上形成β-折叠,改变了树脂的溶胀性能,还有可能将反应的活性位点埋藏在树脂里面,这样使得反应很难进行,目前报道使        

用的主要方法有:

使用混合溶剂,DMSO/DMF,6N 胍啶/DMF溶液

提高反应温度,或采用微波方法

使用高离液盐,LiCl,NaClO4等。

使用溶胀性能更好的PEG-PS树脂,同时减少树脂担载量(0.05-0.2mmol/g)